葉黃素的提取與抗氧化作用的研究進(jìn)展

 

     葉黃素系一種天然色素，又名“植物黃體素”，廣泛存在于自然界中。早在上世紀(jì)80年代中期，西方醫(yī)學(xué)研究人員就發(fā)現(xiàn)植物所含天然葉黃素是一種性能優(yōu)異抗氧化劑。將一定量葉黃素添加到食品中，可防止人體因器官衰老引起一系列疾病。大量流行病學(xué)證據(jù)表明，葉黃素對視覺有保護(hù)作用，并具有預(yù)防白內(nèi)障、動脈硬化、增強(qiáng)免疫力等功效，特別在預(yù)防癌變發(fā)生、延緩癌癥發(fā)展等方面起著重要作用，是目前國際上功能性食品成分研究中一個熱點(diǎn)。

1.葉黃素結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)
葉黃素(lutein)屬于類胡蘿卜素色素之一。類胡蘿卜素按其化學(xué)結(jié)構(gòu)和溶解性分為兩類，即：
1.胡蘿卜素類(carotenes)：系共軛烯烴，溶于石油醚，難溶或不溶于乙醇，包括：
(1)?—胡蘿卜素、?—胡蘿卜素、?—胡蘿卜素，分子式C40H68，具有VA前體功能。自然界分布很廣，在動物、植物、微生物體內(nèi)均有存在，但主要存在于胡蘿卜、水果、蔬菜中。
(2)蕃茄紅素(leopene)，分子式C40H68，不具VA前體功能，但具有強(qiáng)抗氧化消除自由基功能，主要存在于蕃茄、西瓜、紫色柚中。
2.葉黃素類(xanthophylls)：系共軛多烯烴含氧衍生物，并可以醇、醛、酮、酸形式存在，溶于乙醉，不溶于乙醚。葉黃素類主要包括：
(1)玉米黃素(zeaxanthin)，分子式C40H68O2，主要存在于玉米、辣椒、桃、柑桔、蘑菇中。
(2)隱黃素(cryptozanthin)，分子式C40H68O，主要存在于番木瓜、南瓜、辣椒、黃玉米中。
(3)葉黃素(lutein)，分子式C40H68O2，又叫黃體素，主要存在于萬壽菊(金盞花)、甘藍(lán)、菠菜等植物中。
(4)辣椒紅素(capsanthin)，分子式C40H68O3，主要存在辣椒中。
(5)桅子黃(藏紅素)，存在于桅子果實(shí)中。
在類胡蘿卜家中，葉黃素類與胡蘿卜素類不同點(diǎn)，從分子結(jié)構(gòu)看，就是比胡蘿卜素類多含氧元素。
葉黃素獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)不僅決定其顏色，也決定其物理化學(xué)性質(zhì)。葉黃素分子有一條含40個碳原子長鏈，其中有多個共扼雙鍵，正是這些共軛雙鍵使葉黃素具有鮮明顏色和抑制自由基能力。玉米黃素與葉黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，在分析中很難將它們區(qū)分開來，因此很多研究總是將它們作為一類物質(zhì)報道。它們具有相同雙鍵數(shù)，然而其中一個雙鍵位置不同，在葉黃素中這個雙鍵形成烯丙基經(jīng)基末端，使其化學(xué)活性更強(qiáng)；而玉米黃素中相應(yīng)雙鍵則與相鄰直鏈雙鍵形成共軛體系。葉黃素(Lutein)及玉米黃素(Zeaxanthin)結(jié)構(gòu)式見下圖：
葉黃素含有C、H、O元素，鏈末端還有羥基基團(tuán)。葉黃素在細(xì)胞膜上存在方式是疏水長碳鏈埋于磷脂分子層中，而親水性羥基留在膜的兩側(cè)，這種定位可使葉黃素、玉米黃素最大程度與極易氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)合在一起，以增強(qiáng)細(xì)胞膜強(qiáng)度。在穩(wěn)定性方面，研究表明游離葉黃素對熱極不穩(wěn)定，葉黃素月桂酸單酯(ML)穩(wěn)定性稍強(qiáng)，而月桂酸二酯(DL)對熱極為穩(wěn)定。ML、DL對紫外光敏感性都比游離葉黃素差。結(jié)果表明，葉黃素游離羥基與脂肪酸醋化后可提高對光穩(wěn)定性，這也正是商品化葉黃素產(chǎn)品多以葉黃素酯型一個原因[4]。

2.葉黃素來源
葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中天然色素，是構(gòu)成玉米、蔬菜、水果、花卉等植物色素主要組分。據(jù)國外研究，葉黃素在甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、菠菜等深綠色葉菜及金盞花(亦稱萬壽菊，tagetse erecta)等花卉中含量最高[5,6]；其次，南瓜、桃子、辣椒、芒果、柑橘中含有豐富“葉黃素醋”，也是葉黃素前體。
葉黃素首次提取是在1831年，由Heinrich Wihelm Ferdinand Wackenroder從胡蘿卜根中提取。此后，Berzdlius在1837年從秋天黃葉中提取葉黃素，隨后，其他研究人員也在海藻和蛋黃中相繼提取葉黃素。文獻(xiàn)表明，茶葉中含有豐富葉黃素。在自然界不同來源果蔬，其葉黃素含量不同，且各地不同來源、不同單位分析結(jié)果也千差萬別，表1是美國邁阿密國際大學(xué)1995年測定葉綠素和玉米黃素的結(jié)果。
從以上資料可看出，自然界食用蔬菜、水果中，葉黃素含量較少，且差別很大，若直接從果蔬中提取葉黃素，成本將十分高昂。所以國內(nèi)外提取葉黃素工業(yè)生產(chǎn)，均以葉黃素含量較高金盞花為原料提取精制而成。
在我國，金盞花即萬壽菊，有悠久中草藥種植歷史。萬壽菊花和葉，有清熱化痰、補(bǔ)血通經(jīng)、去瘀生新功效。中國農(nóng)大惠伯棣等，深入研究從萬壽菊提取葉黃素技術(shù)，經(jīng)研究指出，萬壽菊類胡蘿卜素總含量可超過1 mg/g鮮重。表2是萬壽菊中類胡蘿卜素組成含量。
表1 不同果蔬中葉綠素和玉米黃素的含量(μg/100 g)
果蔬葉綠素玉米黃素
甜玉米522437
菠菜7400
豆瓣菜11000
椰菜2000
胡椒粉（橙色）25008500
胡椒粉（綠色）1100
豌豆2000
杏干10031
蘋果4341

表2 萬壽菊中類胡蘿卜素組成含量
類胡蘿卜素類含量（mg/kg干重）
葉黃素2.13
葉黃素酯11.21
玉米黃素0.56
其它類胡蘿卜素2.56
合計16.4

除從金盞花中提取葉黃素外，其它公司則在探索新的葉黃素生產(chǎn)途徑。如南美洲Henkle公司已從來源豐富南瓜和桔子榨汁后殘渣中提取“葉黃素酯”(商品名Xangold )，因醫(yī)學(xué)專家早已證實(shí)：葉黃素酯在人體內(nèi)能自動轉(zhuǎn)化成葉黃素，故葉黃素酯與葉黃素一樣可作為新型食品添加劑使用，葉黃素酯提取成功大大拓展葉黃素來源。

3.葉黃素提取方法
科學(xué)家們對葉黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)研究表明：它具有3個屬性中心，8種立體異構(gòu)體(實(shí)際上自然界只存在一種異構(gòu)體)。因為工藝太復(fù)雜，通過化學(xué)人工合成單一異構(gòu)體葉黃素至今尚未成功，目前只有從天然植物中提取葉黃素才含有呈抗氧化作用生物活性物質(zhì)。國外一些公司正在探索新的葉黃素生產(chǎn)途徑，目前葉黃素提取方法主要有以下幾種：
3.1有機(jī)溶劑浸提法
常用有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、石油醚等。萬壽菊中黃色素在中性條件下難溶于水，而在乙醇中，其溶解度增加較多。因此，選用乙醇作溶劑在堿性條件下進(jìn)行提取，提取液呈棕黃色，經(jīng)減壓蒸餾、濃縮、沉淀、干燥得褐色固體。宋昊等[9]研究萬壽菊中葉黃素在幾種有機(jī)純?nèi)軇?四氫呋喃、石油醚、正己烷、丙酮)及這些溶劑和乙醇二元混合溶劑中溶解規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)二組分混合溶劑對葉黃素浸取效果比純?nèi)軇┖�。在二組分混合溶劑中，葉黃素溶解度與溶液極性(反映在溶劑配比上)關(guān)系往往表現(xiàn)為呈上拋物線關(guān)系。在其它實(shí)驗條件均相同時，超聲波振蕩、升高溫度可提高溶解效率36倍，原料顆粒越小，溶解效率也越高。
3.2干燥法
研究成功一種新型轉(zhuǎn)筒式干燥機(jī)，用以干燥和捶擊萬壽菊或萬壽菊花瓣，可從中提取葉黃素。當(dāng)捶擊比率不同時，捶擊效率就在70%90%之間波動。葉黃素多少取決于干燥時間長短;但在相同干燥時間里，70℃下干燥提取葉黃素含量比60℃下提取葉黃素含量要少。
3.3高效液相色譜分析法
以二氯甲烷(22.5 ml)+乙腈(9.5 ml)+甲醇(67.5ml)+水(0.5 ml)為流動相，流量為1.0 mL/min。使用光度檢測器(波長450 nm)檢測分離后類胡蘿卜素和葉綠素。樣品進(jìn)樣體積為20μl。在此條件下，葉黃素、葉綠素b、葉綠素a、番茄紅素、α—胡蘿卜素和β—胡蘿卜素保留時間分別為3.0 min, 4.9 min, 6.6 min, 12.1 min, 14.6 min和15.3 min。取螺旋藻培養(yǎng)液(通過測定光密度(560 nm)得出培養(yǎng)液中螺旋藻干重)于離心管中，離心后棄去溶液，加水洗滌后，加入2mL體積分?jǐn)?shù)的90%丙酮水溶液，置于超聲波發(fā)生器水浴上，使螺旋藻破碎。離心后取上層提取液用高效液相色譜法測定葉黃素/玉米黃質(zhì)、β—胡蘿卜素及葉綠素a含量。其最高含量分別為：1.65μg/mg, 2.15 pg/mg和21.4 pg mg。
高速逆流色譜技術(shù)。Wei等[11]用高速逆流色譜技術(shù)(HSCCC)從萬壽菊中提取葉黃素，得出最佳流動相組成為：庚烷: 氯仿: 氫化甲烷=10:3:7 (v/v/v)，用HPLC測定提取物含葉黃素純度大于98.5%。
3.4膜分離技術(shù)
目前天然色素提取大多采用浸提、蒸發(fā)濃縮、溶劑提純等傳統(tǒng)工藝，存在能耗高、溶劑需回收、過程復(fù)雜等問題，且產(chǎn)品純度往往不高。因此，無論從降低成本還是提高產(chǎn)品質(zhì)量角度來看，將膜分離技術(shù)用于天然色素提取是極有價值的。采用陶瓷膜微濾(MF)，對浸提液進(jìn)行精濾提純，再用反滲透膜(RO)濃縮過濾液。
這種工藝以膜分離技術(shù)為主體，替代傳統(tǒng)乙醇提純和蒸發(fā)濃縮，工藝過程簡單、色素溶液基本處于常溫操作狀態(tài)，既節(jié)約能源，又保證色素產(chǎn)品質(zhì)量。
3.5微波加熱法
楊麗飛、鄧宇介紹以茶葉為原料，以6#溶劑為介質(zhì)，用微波加熱法提取葉黃素，并通過改變?nèi)軇�濃度、微波功率、提取時間等條件對產(chǎn)品提取率影響進(jìn)行探討，獲得最佳提取條件。結(jié)果表明：物料比(w/v)1:25，時間30s，微波浸提2次，葉黃素浸提率達(dá)到65.45。該方法與傳統(tǒng)提取方法相比，省溶劑，大大提高提取效率。
3.6萃取法
從萬壽菊花中萃取葉黃素，青島高科技工業(yè)園青大天然產(chǎn)物研究所已形成工業(yè)化生產(chǎn)，其提取工藝為：萬壽菊鮮花→發(fā)酵→干燥→造粒→正己烷萃取→負(fù)壓蒸發(fā)分離→葉黃素樹脂。
另有超臨界CO2萃取法。該方法將萬壽菊鮮花經(jīng)發(fā)酵、干燥、粉碎后做原料，用超臨界CO2以乙醇作夾帶劑萃取萬壽菊花浸膏，將萬壽菊花浸膏經(jīng)氫氧化鉀皂化得到水溶性天然食用色素葉黃素樹脂。該方法工藝簡單、能耗低、環(huán)境友好；產(chǎn)品純度高、色調(diào)正、耐熱耐光性好、色澤穩(wěn)定。

3. 葉黃素的抗氧化作用
葉黃素作為一種抗氧化劑可抑制活性氧自由基活性，阻止活性氧自由基對正常細(xì)胞破壞。單線態(tài)氧游離基和過氧化物游離基既可從機(jī)體正常代謝中產(chǎn)生，又可受諸如吸煙、空氣污染、輻射、特定藥物和環(huán)境毒素等影響而大量產(chǎn)生。據(jù)認(rèn)為，活性氧自由基可與DNA、蛋白質(zhì)、脂類發(fā)生反應(yīng)，削弱它們生理功能，并進(jìn)一步引發(fā)如癌癥、動脈硬化、及眼睛黃斑變性等慢性病發(fā)生。葉黃素可焠滅單線態(tài)氧，從而保護(hù)機(jī)體免受傷害。
3.1對體外證據(jù)的研究
生物體系產(chǎn)生幾種高度氧化的游離基，有單線態(tài)氧、羥基游離基、超氧化物游離基、過氧化氫、長碳鏈氫過氧化物、過氧化物游離基。這些游離基通過三種不同的途徑與類胡羅卜素反應(yīng)：電子轉(zhuǎn)移、脫氫作用和加合作用。一直稱包括葉黃素在內(nèi)的類胡蘿卜素為天然抗氧化劑。
類胡蘿卜素容易被氧化，多烯鏈?zhǔn)�去電子，生成陽離子自由基。類胡蘿卜素“優(yōu)先”被氧化生成陽離子自由基，反過來陽離子自由基被抗壞血酸還原為原來的類胡蘿卜素。這一學(xué)說解釋了類胡蘿卜素怎樣阻止多聚不飽和脂肪酸、核酸和蛋白質(zhì)的不可逆氧化作用。Truscott在體外化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗研究：在細(xì)胞膜內(nèi)與活性氧游離基反應(yīng)得到疏水維生素E陽離子游離基，它能夠被與膜結(jié)合的類胡蘿卜素如玉米黃質(zhì)再生，反過來生成的類胡蘿卜素陽離子可被膜體系外的維生素C再次還原。這種體外的反應(yīng)實(shí)驗符合抗氧化作用學(xué)說，為深入探索類胡蘿卜素抗氧化功能提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)[12]。
Burton和Ingold提出過氧化物游離基直接加到類胡蘿卜素上—游離基加合作用理論[13]。他們認(rèn)為這種反應(yīng)機(jī)制產(chǎn)生了能直接與O2作用的碳為中心的類胡蘿卜素游離基。次級反應(yīng)產(chǎn)生類胡蘿卜素過氧化物游離基，它的生成取決于氧分壓條件。當(dāng)?shù)脱醴謮簳r，類胡蘿卜素與過氧化自由基(ROO?)反應(yīng)生成類胡蘿卜素自由基(CAR?)，后者可與ROO?反應(yīng)生成ROOCAR，從而阻斷脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(如：CAR + ROO?→ROOH + CAR? CAR?＋ ROO?→ROOCAR)。但高氧分壓時，類胡蘿卜素與ROO?反應(yīng)生成類胡蘿卜素過氧化自由基(CAROO?)，后者可與不飽和脂肪酸(LH)發(fā)生反應(yīng)，引起脂質(zhì)過氧化，發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，從而表現(xiàn)為促氧化作用(如：CAR?→ CAROO?+ LH → CAR + LOOH)。氧分壓足夠高時，由于比消耗的產(chǎn)生更多的游離基，常把依賴O2的步驟稱為促氧化效應(yīng)。
Martin和他的同事也認(rèn)為低氧分壓時，許多類胡蘿卜素是重要的抗氧化劑，阻止底物被過氧化物游離基氧化。當(dāng)氧濃度增加時，氧生成的過氧化游離基占主要因素，壓力足夠高（如1atm）時，將失去抗氧化劑能力。但是，對于生理狀態(tài)的氧分壓和類胡蘿卜素濃度而言，促氧化步驟影響太小，類胡蘿卜素仍有良好的鏈?zhǔn)娇寡趸�能力�?br /> 2000年李叢民、尹海川通過添加葉黃素和硒化合物入卷煙中，采用電子自旋共振波譜法和原子熒光光譜法分析葉黃素和硒化合物對清除卷煙焦油中自由基效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自由基峰高隨葉黃素或硒化合物含量增加而降低。另外，葉黃素還能增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。
3.2對體內(nèi)證據(jù)的研究
目前，人們對視網(wǎng)膜內(nèi)類胡蘿卜素可能存在的抗氧化作用仍然感興趣。Rapp等和Sommerburg等對視網(wǎng)膜黃斑中心附近和周邊區(qū)域分離的桿狀細(xì)胞外部片段進(jìn)行仔細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)中都存在葉黃素和玉米黃質(zhì)。由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和外部片段氧化作用產(chǎn)生的損害非常大，所以要求葉黃素和玉米黃質(zhì)有抗氧化功能。醫(yī)學(xué)上也有重要證據(jù)表明AMD病是由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和外部片段的氧化降解和游離基過程產(chǎn)生的。
葉黃素和玉米黃質(zhì)由于吸光能力很強(qiáng)，可在視網(wǎng)膜內(nèi)部形成一種很有效的藍(lán)光過濾器，這種藍(lán)光能深入眼睛內(nèi)部。黃斑色素主要累積在由許多光感受器神經(jīng)軸突組成的Henle纖維細(xì)胞層中，其中神經(jīng)軸突覆蓋在光感受器上。在藍(lán)光到達(dá)脆弱的組織結(jié)構(gòu)光感受器、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和下部的脈絡(luò)膜血管層之前，黃斑類胡蘿卜素削弱了藍(lán)光。一般認(rèn)為可能是降低藍(lán)光強(qiáng)度能有效減少對視網(wǎng)膜氧化的壓力，降低程度有時高達(dá)90％，通常是40％，由此可充分解釋一些流行病學(xué)研究中觀察到的患AMD危險性降低的現(xiàn)象。現(xiàn)今許多研究證明了黃斑類胡蘿卜素能保護(hù)視網(wǎng)膜，免受到暴露在強(qiáng)烈藍(lán)光下引起的損害。
Henle纖維細(xì)胞層內(nèi)發(fā)現(xiàn)的葉黃素和玉米黃質(zhì)具有過濾光的能力，也間接的說明它們的抗氧化功能。由于它減少了藍(lán)光產(chǎn)生的游離基的比率，從而減少了過氧化游離基誘導(dǎo)的氧化鏈反應(yīng)的幾率。黃斑色素的抗氧化功能最早由Kirschfeld提出，雖然不是通常意義的化學(xué)抗氧化作用機(jī)理，但這種抗氧化功能也是相當(dāng)重要的。大多數(shù)組織中的氧分壓很低，30mmHg或者更低。視網(wǎng)膜的外片段氧分壓很高，可能通過藍(lán)光誘導(dǎo)的光敏氧化生成高比率的單線態(tài)氧，最終使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆損害。
視網(wǎng)膜中除了主要的黃斑色素組分葉黃素、玉米黃質(zhì)和內(nèi)消旋玉米黃質(zhì)外，還有少數(shù)幾種微量組份。雖然沒有類胡蘿卜素抗氧化活性的直接證據(jù)，視網(wǎng)膜中氧化代謝物的存在至少與上面提到的學(xué)說相一致。同樣，氧化／還原途徑形成的內(nèi)消旋玉米黃質(zhì)、3S,3S’玉米黃質(zhì)和環(huán)氧化物，它們的存在也與它們積極參與視網(wǎng)膜內(nèi)的氧化代謝過程的學(xué)說相一致。這些都說明了人體視網(wǎng)膜內(nèi)高濃度葉黃素和玉米黃質(zhì)的存具有抗氧化作用，可降低老年黃斑變性�。ˋMD）的發(fā)病機(jī)率。

4.應(yīng)用前景
葉黃素對人體的重要生理功能已引起廣泛關(guān)注。目前研究人員已從天然物質(zhì)中成功地提純得到葉黃素酯，并將其作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑進(jìn)行推廣，如Salt Lake Citybased Weider Nutrition lnternational, Inc.生產(chǎn)的Schiff牌的營養(yǎng)強(qiáng)化劑已實(shí)現(xiàn)商品化，種類有10%、20%、30%、40%、60%等不同純度的產(chǎn)品。提取后的葉黃素結(jié)晶呈桔紅色，由于它是從天然物質(zhì)制得，因此食用安全、可靠，而且在人體消化道內(nèi)容易被水解、吸收。對于葉黃素，USDA目前雖未給定出膳食推薦量，但Lutein esters于2002年已被FDA認(rèn)定為GRAS物質(zhì)，GRN NO.110。葉黃素作為食品添加劑，市場將是十分廣闊的[17]。酯在美國市場上十分暢銷。美國2004年調(diào)查結(jié)果顯示，葉黃素類食品、低糖食品、防心血管疾病食品等是功能性食品發(fā)展趨勢。
近年我國葉黃素產(chǎn)量逐年上升，但都系為粗品，主要用于動物飼料添加劑或粗品出口，主要品種有葉黃素酯，葉黃素粉末(深棕色)，葉黃素含量10 g/kg。制取高含量高純度葉黃素，用于食品和醫(yī)藥，技術(shù)上尚有一定難度。國內(nèi)中國農(nóng)大，北京大學(xué)，上海交大等，均開展高純度葉黃素研究工作，葉黃素純度可達(dá)95%以上[20]，但葉黃素應(yīng)用在我國尚未引起食品工業(yè)界重視。葉黃素因?qū)θ梭w具有重要生理功能而日益受到關(guān)注，作為一種功能因子在多領(lǐng)域應(yīng)用拓展將是今后重點(diǎn)，可以預(yù)測，葉黃素開發(fā)前景將十分光明。